干货：肝纤维化研究中如何精准靶向肝星状细胞？

肝脏是机体重要的代谢器官承担着解毒、氧化、肝糖原储存以及蛋白质合成与分泌等多种生理功能。与此同时肝脏还直接或间接参与多条关键代谢通路与众多遗传性疾病及慢性肝病密切相关。在各种肝脏疾病中肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化甚至肝癌进展的重要病理过程。而肝星状细胞Hepatic Stellate CellsHSCs则是推动肝纤维化发生发展的核心效应细胞。正常情况下HSCs处于静息状态其胞质内富含维生素A脂滴。当肝脏受到持续损伤时HSCs会逐渐活化转分化为肌成纤维细胞样表型并大量分泌胶原蛋白等细胞外基质成分最终导致纤维化和瘢痕组织形成。因此如何在体内精准靶向HSCs并实现特异性基因调控已成为肝纤维化机制研究中的关键问题。随着病毒载体技术的发展借助病毒载体进行肝脏基因水平调控已成为研究热点。相较于腺病毒载体重组腺相关病毒rAAV具有免疫原性低、长期稳定表达、血清型丰富、宿主范围广等优势在肝脏疾病机制研究和基因治疗领域占据重要地位。基于和元生物多年肝脏疾病研究项目服务经验以及大量客户案例总结实现肝纤维化研究中HSC精准靶向通常需要综合考虑三个关键因素血清型选择、启动子选择以及递送方式。第一步选择合适的AAV血清型在肝星状细胞相关研究中AAV8和AAV6是目前应用最广泛的两种血清型。AAV8肝脏递送领域的经典选择AAV8是目前肝脏研究中应用最成熟的血清型之一。研究表明AAV8能够高效转导小鼠肝脏通过静脉注射对肝脏的转导率可达到90%以上同时具有较长的表达持续时间。因此无论是在肝脏疾病机制研究还是基因治疗研究中AAV8均被广泛采用。根据和元生物多年肝脏项目服务经验AAV8也是肝纤维化、MASLD及MASH相关研究中最常被选择的血清型之一。AAV6活化肝星状细胞的重要工具除了AAV8之外有研究发现AAV6对于活化状态的肝星状细胞具有趋向性因此在肝纤维化研究中同样受到广泛关注。发表于《Cell Stem Cell》的研究显示无论采用静脉注射还是肝内注射AAV6-EYFP均能够有效转导活化的肝星状细胞证明AAV6具有良好的HSC靶向潜力。这一发现使AAV6成为研究活化HSC功能的重要工具。图1 静脉注射左和肝内注射右AAV6-EYFP有效转导活化的肝星状细胞Milad Rezvani, et al., Cell Stem Cell, 2016第二步选择HSC特异性启动子仅依靠血清型并不能完全实现细胞特异性表达启动子的选择同样至关重要。GFAP启动子胶质纤维酸性蛋白Glial Fibrillary Acidic ProteinGFAP是肝星状细胞的重要标志物之一。已有大量研究表明GFAP启动子能够介导肝星状细胞特异性表达因此成为目前HSC研究中应用最广泛的启动子之一。结合和元生物服务案例来看目前许多肝纤维化和MASH研究均采用AAV8-GFAP组合实现目标基因在HSC中的特异性表达或敲低。α-SMA启动子当肝脏发生损伤时HSCs逐渐活化并表现出肌成纤维细胞特征α-SMA表达明显升高。因此对于关注活化肝星状细胞的研究也可利用α-SMA启动子实现活化HSC特异性基因调控。第三步选择合适的递送方式肝脏拥有丰富的血液供应因此既可以采用局部注射方式也可以采用系统给药方式进行AAV递送。根据和元生物肝脏靶向技术平台及项目经验目前肝脏研究中最常见的递送方式主要包括直接注射和系统注射两大类。其中肝叶直接注射、门静脉注射等方式能够获得较高的局部转导效率但操作相对复杂对动物创伤较大。相比之下尾静脉注射操作简单、重复性好因此成为目前应用最广泛的肝脏递送方式之一。对于成年小鼠肝脏研究中常见的AAV给药剂量通常为1–2×10¹¹ vg/只对于需要更高转导效率的实验也可根据研究目的调整递送方式和给药剂量。AAV如何验证肝纤维化关键基因功能完成血清型、启动子和递送方案设计后研究人员通常会利用AAV开展基因敲低或过表达实验从而验证候选基因在肝纤维化中的作用。案例一HSC特异性敲低Mmp7缓解肝纤维化代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎MASH是全球肝脏相关疾病和死亡的重要原因之一。近期上海交通大学医学院附属第六人民医院科研团队发表于《Cell Metabolism》的研究发现高糖饮食尤其是果糖可通过重塑肠道菌群代谢促进内源性乙醛生成进一步上调肝星状细胞中的MMP7表达从而推动MASLD向MASH进展。为了验证MMP7在HSC中的作用研究人员利用和元生物构建的AAV8-GFAP载体在肝星状细胞中特异性敲低Mmp7。结果显示抑制HSC来源的MMP7后高脂高果糖饮食HFHFD诱导的肝纤维化得到显著缓解。图2 抑制HSCs来源的MMP7显著减弱纤维化Yajun Tang, et al., Cell Metabolism, 2026案例二HSC特异性敲低CK2α减轻肝纤维化蛋白激酶CK2是一种促生存激酶其在肝纤维化中的作用此前尚不明确。温州医科大学研究团队发现CK2α对于维持HSC活化和纤维化表型至关重要。研究人员利用和元生物构建的AAV8-GFAP载体在肝星状细胞中特异性敲低CK2α。结果显示该策略能够减少肝脏胶原沉积并缓解CCl4诱导的小鼠肝纤维化。图3 HSCs特异性敲低CK2α可减轻CCl4诱导的肝纤维化Junfu Fan, et al., British Journal of Pharmacology, 2022案例三HSC中过表达Mfap2调控炎症与细胞外基质重塑除了基因敲低之外AAV同样可用于基因过表达研究。首都医科大学北京友谊医院研究团队利用和元生物构建的AAV6在活化肝星状细胞中过表达Mfap2以探究其在肝纤维化中的作用。研究结果显示虽然Mfap2过表达并未改变肝纤维化的组织学进展但能够抑制肝内炎症反应以及细胞外基质重塑过程。图4 HSCs过表达Mfap2可抑制肝内炎症和细胞外基质重塑Wen Zhang, et al., Theranostics, 2025经验总结结合公开发表文献、和元生物肝脏靶向技术平台数据以及大量客户项目经验在肝纤维化研究中实现肝星状细胞精准靶向的经典策略通常为AAV8 GFAP启动子 尾静脉注射其中AAV8负责高效肝脏递送GFAP启动子实现HSC特异性表达而尾静脉注射则兼具操作便捷性和良好的体内转导效果。对于关注活化肝星状细胞的研究则可进一步考虑AAV6 GFAP启动子目前该类策略已被广泛应用于MMP7、CK2α、MFAP2等多个肝纤维化关键基因的体内功能验证研究。对于MASLD、MASH及肝纤维化机制研究而言选择合适的血清型、启动子和递送方案是提高HSC靶向效率、获得可靠实验结果的重要基础。