AXL这个靶点我是从研究肿瘤耐药的那段时间开始真正重视起来的。前几年我们团队在卡梅德生物技术参与抗体药物研发时陆续收到不少临床端反馈一些EGFR抑制剂耐药的患者样本里AXL的表达水平高得反常。一开始以为是检测批次出问题后来连续多轮用IHC和Western blot复核才确认这不是测量噪声而是一条独立的信号通路正在接管肿瘤的生存指令。这几年AXL相关的选择性小分子抑制剂、单克隆抗体和ADC密集进入临床我也有机会把这个受体酪氨酸激酶从头到尾反复梳理了几遍。这篇文章用相对完整的篇幅把AXL信号通路和药物研发的底层逻辑讲清楚既适合刚接触靶向药研发的同行也适合想理解耐药机制与联合用药思路的研究人员内容全部来自实际项目中的复盘和文献交叉验证尽量做到拿来就能用。1. AXL受体酪氨酸激酶的分子特征与生理定位1.1 从TAM家族说起AXL不是一个人在战斗AXL属于受体酪氨酸激酶RTK超家族但它不像EGFR、FGFR那样单独成军而是归属于TAM亚家族。TAM这个名字并不是某个分子的缩写而是取了三个成员的首字母TYRO3、AXL和MERTK。三者共享一段相当保守的胞内激酶结构域同时在胞外配体结合区表现出各自的识别偏好。翻一下进化关系会发现无脊椎动物里基本找不到完整的TAM信号系统它是伴随着脊椎动物免疫系统和神经系统复杂化逐步出现的这也在某种程度上解释了AXL在哺乳动物里为何承担如此多面的角色。我第一次仔细看AXL结构时第一反应是它和大多数RTK形态相似但有三个明显的特征值得单独记。AXL基因定位在人染色体19q13.2编码的前体蛋白约894个氨基酸经翻译后修饰形成成熟的跨膜受体。整个分子大致分三层胞外N端区负责识别配体跨膜区把信号从外向内传导胞内C端包含激酶结构域和多个自身磷酸化位点。胞外部分集中了两次免疫球蛋白样重复序列和两个纤连蛋白III型重复结构域这种拓扑学设计让AXL在空间上能形成适当弯曲的构象以便稳定承接配体复合物。胞内最关键的是激酶结构域但仅仅看催化活性还不够C端尾部那几个酪氨酸残基Y779、Y821、Y866等的磷酸化状态直接决定了后续信号分子能否被招募进来。所谓受体激活并不只是磷酸化本身而是蛋白互作层面的一整套级联反应。如果非要找个生活化类比AXL的胞外段像一个带识别功能的门禁读卡器GAS6就是那张卡门禁读到合法卡片后才会触发后续一系列联动。但AXL比较特殊的是门禁本身出了问题——比如受体过量表达或者结构改变——哪怕没有合法卡片系统也可能出现误动作。这一点在后面讨论配体非依赖激活时还会反复提到。1.2 GAS6AXL最核心的配体与激活逻辑AXL的配体不止一种GAS6和Protein S都能结合TAM家族但从亲和力、信号强度和组织分布来看GAS6毫无疑问是AXL最主要的激活配体。GAS6全称growth arrest-specific gene 6最初是在生长停滞的细胞里发现的一组基因之一当时谁也没想到它后来会变成肿瘤耐药研究里的高频面孔。GAS6在结构上分几个区段N端是维生素K依赖的Gla结构域中间排列着四个类表皮生长因子重复序列C端是两个与性激素结合球蛋白类似的结构域后者正是结合AXL胞外免疫球蛋白样结构域的关键部位。这里有一个做药物研发的人特别需要注意的机制GAS6激活AXL并不是一分子对一分子的简单对接。生理条件下GAS6需要先通过Gla结构域在含有磷脂酰丝氨酸的膜表面富集形成二聚甚至更高阶的复合物然后再把AXL拉到一起。换句话说膜表面的脂质环境会直接改变配体的有效浓度。我在几个PDX模型里踩过这个坑单测组织里GAS6的mRNA水平往往不能准确判断AXL通路激活程度必须同时看GAS6蛋白、AXL膜表达以及样本中凋亡细胞碎片带来的磷脂酰丝氨酸暴露水平三者合起来才能对上信号通路的状态。AXL激酶区遵循经典的RTK激活模型配体诱导受体二聚化胞内激酶结构域相互靠近通过转磷酸化把激活环上的关键酪氨酸残基磷酸化继而募集含SH2结构域的接头蛋白。但AXL还有一个容易被忽略的习性——它和MERTK一样在高表达或发生特定融合事件时会出现配体非依赖性的聚集激活。这个特性直接影响了药物策略的选择单纯阻断GAS6和AXL的结合不一定能完全压制AXL信号研发顶层设计时必须把这条自激活通道算进去。2. 从配体结合到下游效应AXL信号通路的传导核心2.1 三条主通路PI3K/AKT、RAS/ERK与NF-kB配体结合后的故事才算真正进入核心。AXL的胞内尾部和接头蛋白结合后会在不同细胞环境下激活多条信号轴但出现频率最高、文献重复性最好的就是三条PI3K-AKT-mTOR轴、RAS-RAF-MEK-ERK轴和NF-kB轴。听上去都是经典通路但恰恰是这三条轴解释了AXL为什么能同时调控增殖、存活、迁移、代谢和免疫应答。先说PI3K-AKT轴。活化的AXL通过接头蛋白PIK3R1p85亚基直接招募PI3K在膜上生成PIP3把AKT募集到膜上并被PDK1和mTORC2磷酸化激活。AKT一旦激活一方面磷酸化BAD等促凋亡蛋白来抑制凋亡另一方面激活mTORC1调控蛋白合成与自噬。在AXL高表达且依赖该信号的细胞里用AXL抑制剂处理之后最早看到的生化变化就是AKT磷酸化水平下降这也是药效评价里最常用来验证通路打击深度的指标。再说RAS-ERK轴。AXL可以通过GRB2-SOS复合物把RAS拉起带动RAF-MEK-ERK级联。ERK激活后进入细胞核磷酸化一系列转录因子推动细胞周期和EMT相关基因的表达。我在间充质样表型的肿瘤细胞里实测下来AXL驱动的ERK激活常常比AKT更明显这可能跟这类细胞所处的胶原环境对AXL的持续刺激有关。最后是NF-kB轴。这条轴在TAM家族里尤其有特点。AXL被激活后RAS还可以促使IκB激酶活化让NF-kB从胞浆抑制状态释放并转入核内启动炎症因子、抗凋亡因子以及其他RTK配体的转录。NF-kB一旦持续激活就会形成一个正反馈循环AXL促进炎症炎症上调GAS6GAS6再激活AXL。很多微环境高度炎症化的肿瘤样本里都能观察到这种循环的痕迹。2.2 信号节点交互与配体非依赖激活上面几条是线性骨架但在真实组织里AXL的信号远不是一条直线走到底。它更像一个信号枢纽一边接收多种输入GAS6、缺氧、治疗压力、表观修饰一边输出多种效应存活、EMT、耐药、免疫逃逸。想要理解这个靶点就必须接受这种一对多和多对一并存的特点。一个比较常见的交叉节点是AXL与EGFR/HER2之间的跨受体对话。已有体外研究可以在EGF刺激后观察到AXL酪氨酸位点被异源磷酸化反过来EGFR也可以通过共受体机制被AXL信号放大。这种交叉磷酸化的直接后果是即便上游配体被抗体封闭只要另一条RTK通道持续活跃AXL通路仍然会被部分激活。这也是为什么AXL抑制剂单药数据往往因瘤种而异而合理的联合用药收益更稳定。另一个常被忽略的现象还是配体非依赖激活。在过度表达AXL的细胞系里就算去掉GAS6AXL照样可以形成自发同源二聚化来激活下游信号整合素信号也能把AXL拉进复合物。做临床前筛药时如果只用GAS6依赖的实验体系很容易高估抗配体策略的覆盖范围。我个人的建议是在实验设计里同时设置配体依赖和配体非依赖两种刺激条件把两个数据对比着看才会对候选药物的机制边界有一个清醒的认识。3. 肿瘤微环境中的AXL恶性生物学行为的关键推手3.1 表达谱异常与预后关联从TCGA到病理切片AXL在正常成人体内的表达并不算高主要集中在单核巨噬细胞、树突状细胞、血小板和特定上皮组织中。但当它出现在肿瘤细胞表面且表达量显著上调时性质就完全不同了。泛癌数据分析里AXL高表达在胰腺癌、肺腺癌、三阴性乳腺癌、消化道肿瘤和黑色素瘤等多个瘤种反复出现并且多数研究把AXL高表达与更短的总生存期或无进展生存期关联起来。病理诊断环节有个很实际的体会AXL的免疫组化膜阳性信号和mRNA表达水平并不总是一致。细胞膜阳性往往与通路激活状态相关性更好而胞浆弥漫性信号可能代表受体正在内化或者处于非活性状态。做PDX模型筛选时我建议以膜阳性比例作为AXL表达高低的主要判断依据而不是单看总的染色强度。基因层面偶尔也能见到AXL融合或外显子突变但AXL不像ALK或ROS1那样以融合为驱动主导它的突变驱动作用目前仍存争议。真正高频发生的是在肿瘤进化过程中AXL表达作为旁路辅助显著上调。对分子分型不明确的耐药样本把AXL纳入常规IHC或RNA检测清单性价比相当高。3.2 耐药调控从TKI耐药到免疫治疗耐受AXL和耐药的关系是制药公司投入这个靶点的最主要原因。背后的机制大体分两类一是靶向药治疗压力下肿瘤细胞通过上调AXL寻找替代生存信号二是AXL通过调控微环境让免疫细胞袖手旁观。先展开第一类。以EGFR突变型非小细胞肺癌为例使用第三代EGFR抑制剂奥希替尼之后出现耐药的患者中有一部分并不是EGFR自身产生了二次突变而是肿瘤细胞发生了谱系可塑性转变上皮样细胞逐渐向间充质样细胞转化也就是EMT。EMT表型的标志物里AXL高表达几乎是稳定特征。机制上比较公认的解释是微环境中的TGF-β或其它细胞因子激活Snail、Slug、ZEB1等转录因子这些转录因子结合到AXL启动子区大幅抬高AXL的转录水平激活后的AXL反过来又维持EMT状态的稳定性形成闭环。这个AXL-EMT反馈带来一个很具体的后果当EGFR抑制剂把EGFR通路压制住后过表达的AXL接过指挥棒通过PI3K-AKT和ERK轴继续维持细胞存活与增殖。我分析奥希替尼耐药细胞系的RNA-seq数据时发现EMT相关基因簇和AXL表达经常同向变化耐药株比起始株的AXL蛋白水平往往高出数倍。也就是说AXL在耐药样本里不只是伴随现象而是实实在在的旁路驱动者。再看免疫治疗耐受维度。临床数据里AXL高表达与PD-1抗体响应率不佳之间存在负相关机制逐渐清晰。AXL在肿瘤相关巨噬细胞上高表达参与凋亡碎片清除同时促进巨噬细胞向M2型极化降低树突状细胞的抗原呈递效率。肿瘤细胞表面的AXL还能通过激活NF-kB上调PD-L1表达进一步削弱T细胞的攻击力。这样一来AXL几乎同时握着耐药开关和免疫逃逸开关这也就是它能牵动那么多研发资源的原因。3.3 肿瘤微环境层面AXL的整合功能不难看出AXL属于那种自身具备驱动能力、但更重要的是带动周边环境的靶点。它把肿瘤细胞的EMT、存活压力同巨噬细胞极化、T细胞抑制串在了一条链条上。因此评价AXL靶向药物的真实潜力时不能只看体外的肿瘤细胞增殖抑制必须放进包含免疫细胞和基质成分的模型里去看。这也是越来越多AXL药效评价从裸鼠CDX模型转向PBMC重建或全人源化小鼠模型的原因。这种转向成本确实高但信息量完全不一样尤其当研发目标是免疫联合用药时没有完整免疫微环境的单药疗效数据基本说明不了问题。4. 靶向AXL的药物研发管线从开发逻辑到临床数据4.1 小分子抑制剂选择性、多激酶与临床定位AXL的药物研发大体分三条技术路线小分子酪氨酸激酶抑制剂TKI、靶向生物大分子单抗/双抗/ADC以及一些更新颖的调节剂。三条路线的开发逻辑差异很大先看小分子TKI。AXL是标准RTK靶点设计ATP口袋抑制剂自然是最直接的思路。目前小分子按选择性分为多激酶抑制剂和相对选择性AXL抑制剂。多激酶路线里较有代表性的是卡博替尼cabozantinib靶谱覆盖MET、VEGFR2、AXL等。问题在于VEGFR2抑制带来的高血压、疲劳、手足反应等副作用常常迫使临床减量AXL抑制在总体疗效中的贡献很难从临床终点单独拆出来。这类药物的定位更接近多靶点联合打击。相对选择性小分子里bemcentinibBGB324比较有代表性曾进入多项临床研究覆盖非小细胞肺癌、急性髓系白血病和转移性黑色素瘤。它的开发思路从一开始就瞄准EGFR耐药旁路和免疫联合方向。临床前数据支持bemcentinib能够恢复耐药细胞对EGFR TKI的敏感性在肺癌模型里和EGFR抑制剂联用时有协同抑瘤效果。但临床转化过程中也暴露了AXL靶点的普遍难题AXL表达不等于AXL依赖缺乏有效的患者分层标志物使得选择性抑制剂的后期临床研究非常吃亏。另一个常出现在管线列表里的是gilteritinib主要适应症是FLT3突变的急性髓系白血病同时具备AXL抑制活性。在AML里AXL与细胞谱系极性和耐药相关所以FLT3/AXL双靶点设计有它内在逻辑但gilteritinib的药物定位仍以FLT3为主AXL活性属于顺手覆盖。AXL小分子开发的难点不在于拿到一个IC50漂亮的化合物而在于评估选择性窗。AXL与MERTK、TYRO3激酶结构域同源性较高化合物活性稍不留神就会连带打掉MERTK而MERTK在不同细胞类型中的抑瘤与促瘤证据是矛盾的。我在做化合物激酶谱筛选时会把AXL、TYRO3、MERTK三条抑制曲线放在同一张图上对比要求AXL的IC50至少低一个数量级免得整个研发结论被脱靶效应带偏。4.2 大分子策略单抗、双抗与ADC的差异化逻辑小分子抑制剂占据ATP口袋、阻止催化磷酸化但AXL这种受体型的信号并不只依赖激酶活性还存在支架功能、受体间互作等额外维度。这个空档正是大分子药物切入的地方。单克隆抗体路线主要瞄准AXL胞外区目标有两个阻断配体结合诱导受体降解。曾进入临床的DS-8895a就属于AXL靶向的大分子偶联药物方向。大分子优势是特异性高、对AXL的选择更干净同时天然具备内吞机制适合偶联毒性载荷进行精准递送。AXL是目前ADC领域热度上升很快的靶点之一原因正好是肿瘤细胞高表达内吞效率高。资料上看AXL在正常组织表达有限但在间充质样肿瘤或耐药灶表面大幅上调抗体结合后受体快速内化毒素随之释放。相比小分子ADC可以把毒性集中在AXL阳性区域降低全身暴露风险。双特异性抗体的思路也在快速推进比较常见的是AXL结合免疫检查点或另一个RTK比如PD-L1或EGFR目标是加强肿瘤选择性并实现双信号阻断。公开的临床数据还不算多但临床前POC数据已经指出这类双抗在耐药环境里的可行性。评估大分子时有个提示配体非依赖激活是单抗路线需要正视的局限因为受体自身聚集造成的激活仅仅阻断GAS6结合并不一定完全消除。建议提前用高表达AXL且部分配体非依赖的细胞系作为对照模型避免把结合活性误判成信号抑制能力。4.3 联合用药格局EGFR、免疫检查点与化疗的排列组合把AXL抑制当作广谱抗癌药的思路现在基本被放弃了。AXL抑制剂在多数瘤种里很难靠单药交出惊艳的客观缓解率它更核心的价值是解锁耐药或改造微环境让其它治疗真正起效。联合策略里最成熟的是和EGFR TKI的组合。逻辑链条在前面已经说过AXL是EGFR抑制剂耐药的重要旁路理论上压制AXL应该能延迟或逆转EMT相关耐药。实际项目设计应当先筛出AXL高表达亚群再在亚群里评估联合组获益。临床前阶段要留意一个常见问题不是所有耐药细胞都把AXL当作主要驱动有些耐药株虽然AXL表达高但生存更依赖FAK或SRC等信号这时候加AXL抑制剂不一定增效。所以做联合实验之前先做AXL敲低或抑制后的表型确认判断AXL是原因还是伴随现象。免疫联合方向同样值得关注。AXL抑制可以降低肿瘤细胞的PD-L1表达同时促进巨噬细胞向M1型极化把冷肿瘤往热肿瘤方向推。黑色素瘤和非小细胞肺癌里已有临床前及早期临床证据支持AXL抑制剂与PD-1抗体联合的潜力。但直到目前仍然缺乏大型随机对照研究的强证据这与AXL患者分层标准不统一有很大关系。和化疗、放疗甚至其它ADC的联合也在探索总原则是一致的先明确生物学依据再做动物模型验证最后考虑临床启动。AXL这个靶点每一阶段的转化鸿沟都不小没有机制支撑的排列组合式联合很容易在临床前看着有效、一上临床就散架。5. AXL药物研发中容易被忽视的细节与实操建议5.1 患者分层没有生物标志物就没有清晰的临床故事AXL研发走到今天最大的教训就是不筛患者直接进临床大概率会拿到一个模糊不清的结果。AXL高表达并不是在所有肿瘤里均匀出现即便同一癌种原发灶与转移灶、治疗前与治疗后之间也可能差异巨大。临床试验如果没有合适的伴随诊断很容易把潜在受益人群和不受益人群混在一起最终整体生存曲线被稀释到没有统计意义。现阶段比较常用的分层方案包括肿瘤组织AXL免疫组化评分、血浆可溶性AXLsAXL水平、循环肿瘤DNA中的AXL拷贝数变化以及基于转录组的EMT评分。sAXL在机制上与AXL通路激活相关性较好而且可以动态监测治疗过程中的通路状态适合做早期药效动力学标志物。转录组EMT评分更多用于判断耐药亚群操作时要做好算法标准化。我比较推荐的路径是在II期设计里把AXL高表达作为分层因素或入组条件再考虑伴随诊断申报。这样能省掉很多后期重新分组的麻烦。任何有望成为伴随诊断的标志物都需要从一开始就注意分析验证和分析临床验证的证据链构建否则后续注册申报容易卡壳。5.2 临床前评价体系模型选择与数据分析的常见坑AXL药物评价首先会碰到模型问题。传统CDX模型里细胞株如果在体外培养过程中AXL表达发生漂移皮下成瘤后的AXL状态会与预期完全不符。我经手的有些细胞系传代次数一多AXL膜表达明显下调测出来的抑制剂活性会被系统性低估。避免这个坑的办法很朴素接种前和肿瘤收获后各做一次AXL的流式或Western blot确认并且尽量使用低代次细胞。PDX模型在AXL表达稳定性上通常好于CDX因为它保留了原始肿瘤的部分微环境成分但缺点是缺乏完整免疫系统想评估AXL抑制相关的免疫机制时会受限。如果研究重点是AXL抑制与免疫检查点联合建议使用人源化小鼠或同系模型同系模型的优势是天然带有完整免疫微环境缺点是鼠源AXL与人源AXL在配体亲和力上存在差异数据外推时要谨慎。药效读数上除了常规肿瘤体积抑制率TGI建议同步检测通路抑制深度p-AXL、p-AKT水平和凋亡标志物。TGI只说明肿瘤缩没缩但AXL抑制剂的药理作用是通路依赖性的必须把PK-PD关系和药效结果绑定解读。我经常看到项目报告出现TGI中等但p-AXL抑制90%的组合这个数据其实说明化合物的肿瘤内暴露很好但肿瘤生长可能主要受其它驱动信号支撑。对联合用药设计来说这反而是非常关键的信息。5.3 研发决策中的适应症优先级与受体降解问题AXL领域研发还有两个容易被忽视的决策点我想单独说一下。第一个是适应症优先级。开发顺序上我倾向于先把耐药机制明确的适应症作为突破口比如EGFR突变非小细胞肺癌耐药后的AXL高表达人群再往更广适应症拓展。机制越清晰的适应症临床结局越容易好看泛瘤种开发不是不能做但前提是标志物足够可靠。第二个是抑制还是降解的路线取舍。大分子药物开发早期就要拍板是仅仅阻断配体结合还是诱导受体内吞降解。两者生物学后果完全不同。如果候选抗体只阻断了配体结合而没有有效促进AXL降解长期给药时可能出现受体再循环导致的通路反弹。因此抗体筛选阶段内吞效率和溶酶体转运能力应该纳入关键检测项而不是只看表面结合活性。AXL领域的竞争已经从有没有人做变成谁做得机制更清楚、数据更扎实。下一阶段胜出的团队大概率不是IC50做得最低的那个而是能把患者分清楚、能准确读出通路抑制深度、能设计好联合方案并坚持做下去的那个。5.4 应用扩展与未来方向除了肿瘤AXL在纤维化疾病和病毒感染研究中的角色也开始受到重视。肺纤维化组织里AXL-GAS6轴的激活可以推动肌成纤维细胞活化与细胞外基质沉积在某些病毒感染的免疫应答中AXL作为内吞受体参与病毒颗粒进入细胞的步骤因此也出现了一些AXL抑制剂抗病毒方向的探索。当然这些对AXL来说都算非主要战场证据级别参差不齐我个人不会把研发资源轻易押上去但生物标志物和组织病理样本的积累可以提前布局。落实到具体课题规划我的习惯是先看AXL信号轴在目标适应症耐药样本中的必要性证据也就是基因敲低或药理学抑制之后能否带来明确的表型变化再决定靶点投入量级。不是所有AXL高表达的肿瘤都依赖AXL生存把依赖关系搞清楚比盲目追求广谱适应症更有价值。如果把AXL药物研发比作打靶信号通路必要性与患者分层就是准星后面药物设计、联合方案和临床开发都围绕这个准星展开。这些年我在多个项目里反复体会到一个靶点能不能做成药很多时候不取决于它有多热门而取决于团队能不能把这个必要性故事讲扎实——AXL恰恰就是这样一个需要把功课做在早期机制验证上的典型靶点。
