1. 第15章被我读成了三张图重组这件事到底解决什么问题Lewins Genes XII 的第15章标题是同源重组与位点特异性重组Homologous and Site-Specific Recombination。我第一次翻这一章的时候读得相当散因为前半本是RecA、RAD51、Holliday连接这些解结构的内容后半本突然跳到λ整合、Cre-loxP、FLP-FRT这些做工具的内容中间隔着一大堆蛋白名字读起来像两篇不相干的综述拼在一起。直到我把它当成同一套化学反应的两种调度方式重新排了一遍这一章才顺过来——同源重组靠的是长同源序列蛋白丝去搜索匹配位点特异性重组靠的是几十个碱基的短识别序列重组酶四聚体去定点切接两者的共同点是都走链交换-形成交叉-解析的路径区别只是谁来保证配对的特异性。这篇笔记写给两类人一类是刚啃完第14章染色体复制、准备进第15章的学生另一类是在实验室里真的要把基因敲掉、要做条件敲除、要写供体模板的人。前一类人关心机制图怎么画、概念怎么区分后一类人关心同源臂留多长、sgRNA放哪里、验证怎么做。我把两边的需求揉在一起写机制部分讲清楚为什么是这样实验部分讲清楚我实际怎么操作、哪些参数是经验值、哪些地方最容易翻车。1.1 作者为什么把同源重组和位点特异性重组塞进同一章从章节编排看这个安排其实很有讲究。第14章讲的是染色体外复制子第16章讲修复系统第15章夹在中间正好处理DNA被打断以后怎么重新接上这个中间态问题。损伤修复讲的是把断口补回原样重组讲的是把断口接到另一条同源序列上两者的分界线就是有没有用到同源模板。同源重组的特点是它对序列几乎不挑只要同源够长细菌里几十个碱基起步真核里通常要几百个碱基以上就能发生所以它既可以是修复机制也可以是基因重排机制还可以是进化中的洗牌机制。位点特异性重组反过来它对同源的要求极低但对识别序列的要求极高重组酶认的是30~50 bp的特定序列只要这个序列在接哪儿、朝哪个方向接都是可预测的。把它俩放一章本质是给出特异性来源的两个极端一个来自序列长度与匹配一个来自蛋白与短基序的识别。这个视角对做实验的人特别有用。你要做大片段删除用Cre-loxP比用同源重组省事得多因为不需要长同源臂你要做精确的点突变只能用同源重组或者碱基编辑因为位点特异性重组只能搬动整段序列改不了单个碱基。选哪条路取决于你想要的操作精度和片段长度这个判断贯穿了后面所有内容。另外这一章还有一个容易被略过的点两类重组都不是免费的。同源重组会带来基因转换、杂合性丢失、大片段重排位点特异性重组会留下疤痕序列loxP、FRT这类位点本身就是残留多次操作以后基因组里会攒一堆识别位点。做长期传代的细胞系、做多轮基因编辑的时候这些残留会变成隐性负担有时候会在某个意想不到的时间点被内源或外源的Cre-like活性点燃。我在后面第5节会专门说这个坑。1.2 三句话记住这一章的骨架如果只允许留三句话我会这么记第一句同源重组的核心事件是链侵入。一个带3端的单链去找同源双链找到以后把同源链顶开形成D-loop这一步由RecA家族真核里是RAD51/DMC1催化的核蛋白丝完成是所有下游路径的分叉点。第二句Holliday连接只是中间态不是终点。双Holliday连接可以被切开resolution产生交换或不交换两种产物也可以被解开dissolution只产生不交换产物。决定走哪条路的是解旋酶-拓扑异构酶复合物和核酸酶的组合这一点直接决定了遗传图谱上重组率和基因转换的比例关系。第三句位点特异性重组的产物类型由位点方向决定。两个识别位点同向排列重组结果是删除中间片段反向排列结果是倒位放在两条不同的DNA分子上结果是整合或易位。这一条是Cre-loxP、FLP-FRT所有应用的总纲实验设计时先画位点方向再谈其他。把这三句话印在脑子里以后再回去看那些蛋白名字它们就各自有了岗位RecBCD是入口的削链机RecA是搜索器RuvABC是分支迁移马达RuvC是剪刀BLM-TopoIIIα是解结器。名字多岗位就那么几个。1.3 读之前需要垫的三块地基第一块是DNA的拓扑学。重组过程里会出现交叉、缠绕、结扣如果不理解超螺旋、连环体、拓扑异构酶的作用读到dissolution需要拓扑异构酶就会卡住。我的做法是先在纸上画两条同源双链用不同颜色标出正链负链把一次完整的交换画出来画两遍就通了。第二块是核酸酶的作用方式。第15章里出现的酶切法分两类一类切单链产生3突出端一类切双链产生平端或短突出。切法决定了后续是走侵入路径还是走连接路径。这个分类方法在第16章修复系统里还会再用一次早点建立起来后面省力。第三块是遗传学里的几个术语。交换crossover、基因转换gene conversion、交互性reciprocal、非交互性non-reciprocal这四个词在教材里反复出现但初学者经常混。用一句白话概括交换是两边互换一段基因转换是一边单方面改了另一边没变。同源重组的大部分事件其实是非交互的也就是发生了基因转换但没发生交换这一点和很多人直觉相反但它解释了为什么重组率和物理距离的对应关系不是严格线性的。2. 同源重组的机制线从双链断裂走到Holliday连接2.1 DSBR模型四步走完一次交换教材里讲同源重组起点基本都放在双链断裂修复模型上。这套模型是1983年提出来的到今天依然是解释交换型重组的主干框架。它把整个过程拆成四步我按自己的理解重新排了一遍第一步断口处理resection。双链断掉以后核酸酶从5端往内削产生3单链突出。真核里参与的有MRN复合物、CtIP、EXO1细菌里是RecBCD。这一步的产物很关键——它决定了后续侵入的方向也决定了哪一端当进攻方。RecBCD在细菌里还有个特殊行为它沿DNA移动时遇到chi位点一段8 bp的特定序列会被削弱削链活性从而在chi附近留下更长的3单链这就是为什么大肠杆菌的重组热点总是出现在chi附近。第二步链侵入strand invasion。3单链被RecA或RAD51包裹形成核蛋白丝然后去扫描周围的同源双链。找到匹配以后单链置换掉同源双链的一条链形成D-loop。这一步是整个过程的限速环节也是同源搜索特异性的来源。核蛋白丝的直径、螺距、ATP水解速率都会影响搜索效率这也是为什么体外做RecA介导的D-loop实验时缓冲液里的ATP再生系统很关键——ATP一旦耗尽丝就塌了。第三步双Holliday连接形成。D-loop里被置换出来的那条链会跟断裂端的另一侧退火经过延伸和连接形成两个Holliday连接也就是所谓的dHJ。这个结构是四条链两两交叉的X形教材里的经典图就是它。我读的时候一直有个疑问两个交叉点之间那段异源双链heteroduplex是怎么产生的答案就是链侵入后的延伸过程——延伸的长度就是异源双链的长度通常几百个碱基这个长度直接对应基因转换的片段长度。第四步解析resolution。dHJ要被切开才能得到终产物。切法有两种教材叫纵向切和横向切切完以后要么是交换产物要么是非交换产物。更细致的内容在后面小节展开。这四步是一套逻辑闭环但它不是唯一路径。教材特别强调dHJ可以被另一种方式处理——dissolution也就是不解开交叉而是把两个交叉点往中间推最后合成一个再由解旋酶-拓扑异构酶复合物整体解开只产生非交换产物。这个路径在真核里主要由BLM和TopoIIIα执行它的存在解释了一个长期困扰为什么有些生物的重组事件里基因转换很多但交换很少。2.2 RecA与RAD51同源搜索到底在搜什么我读这一章最想搞清楚的问题就是同源搜索四个字到底意味着什么。教材给的说法是核蛋白丝与双链DNA碰撞快速解离直到遇到足够长的同源序列形成稳定的联合体。这句话听着像玄学但它的物理图像其实很清晰。RecA真核里是RAD51减数分裂里还有DMC1在ATP存在下聚合成螺旋丝每个单体覆盖大约3个碱基整个丝把单链撑成一种伸展的、碱基朝外的构象便于和被搜索的双链做碱基配对试探。试探的过程是非特异的碰撞-解离极快只有当连续配对达到一定长度体外实验里通常需要十几个碱基以上联合体才会稳定下来。稳定以后ATP水解驱动构象变化把侵入链锁进去同时把被置换的链推出来。这里有几个实验上很实用的推论同源长度有阈值。太短的同源臂在体外几乎做不出稳定联合体在细胞里重组效率也断崖式下降。这就是为什么做基因打靶时同源臂不能太短传统做法是每侧2~10 kb用CRISPR做点突变时每侧至少也要30~40 ntssODN或500 bp以上质粒供体。单链比双链更容易侵入。所以供体模板设计成单链寡核苷酸往往比双链质粒效率高尤其是在做小改动的时候。序列的细微差异会拖慢搜索。一个碱基错配就会让联合体不稳定错配修复系统还会把它纠正回去这就是基因转换的方向性偏倚来源之一。真核里RAD51的装载不是自发的需要一系列中介蛋白BRCA2负责把RAD51送到单链上RAD51旁系同源蛋白Paralogs帮助稳定丝RAD54负责丝的移动。读到这一层我才明白为什么某些肿瘤里BRCA2失活会导致同源重组缺陷——不是RAD51本身坏了是搬运工没了。这一点在实验里也有对应做体外重组实验时如果只用纯化的RAD51效率往往很低加上RAD54和RPA以后活性才像样。2.3 SDSA与基因转换多数重组其实不交换如果只记DSBR会得到一个错误印象同源重组总是产生交换。实际上真核细胞里有丝分裂时的重组绝大多数是非交换的走的路径叫合成依赖链退火SDSA。SDSA的过程可以这么理解侵入链延伸一段以后不去捕获第二条链形成第二个交叉而是直接撤退解离出来退火到断裂端的另一侧然后补齐缺口、连接。整个过程只形成一个Holliday连接或者根本不形成解完以后得到的是只有基因转换、没有交换的产物。这条路径的意义非常大。第一它保证了有丝分裂细胞在修复断裂时不轻易重排基因组交换是有风险的因为它会让染色体臂上的等位基因组合发生永久改变。第二它解释了为什么重组热点和交换热点在基因组上并不完全重合——很多热点只发生基因转换。第三它是实验设计里的一个隐含变量如果你用同源重组做点突变敲入你实际依赖的可能主要是SDSA而不是DSBR这决定了供体模板最好是断口两侧各留一段、中间带改动的结构而不是整段长同源臂的环状质粒。基因转换本身还牵涉到错配修复。异源双链形成以后如果两条链在某个位置有碱基差异错配修复系统会挑一条链改正挑哪条链有一套偏向规则链的方向、甲基化状态、邻近序列结果就是某些等位基因被优先复制到另一条染色体上。这个现象在遗传学里叫转换偏倚GC bias读起来有点绕但如果你做的是杂合细胞系的敲入它会实实在在影响你拿到纯合克隆的概率。2.4 减数分裂里的Spo11与交叉干涉减数分裂的重组起点是一个专门的核酸酶Spo11它和拓扑异构酶VI的催化亚基同源切断双链时会和5端形成共价中间体然后被切掉、被切除留下3突出端。这一步是程序化的发生在特定的热点上热点的位置由染色质状态和序列共同决定。减数分裂重组有两个特征值得单独拎出来。一个是交叉干涉一个位置发生了交换附近再发生交换的概率会下降。这个现象的经典解释是应力模型后来也有了基于扩散的定量模型但教材给的直观版本已经够用——交叉点之间的物理距离不能太近太近了结构上不稳定。另一个是交换的必需性大多数生物至少需要每个染色体臂上一个交叉才能保证减数分裂时同源染色体正确分离否则会出非整倍体。我读这一节的时候联想到了实验里的一个常见问题为什么用生殖系做条件敲除比如用Spo11或DMC1的调控元件驱动Cre的时候效率波动很大部分原因就在这里——减数分裂重组的启动有时序热点的活跃程度随发育阶段变化Cre表达窗口对不上就敲不干净。这一点在体细胞敲除里不太会遇到但在做生殖系传递的实验里是实打实的变量。3. 位点特异性重组34 bp做出的可编程开关3.1 两套化学机制酪氨酸重组酶与丝氨酸重组酶位点特异性重组酶按催化残基分两大家族酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶。教材把这两类放在一起对比我觉得这是全章最值得记住的对比之一因为它直接决定了实验里能不能得到可逆或不可逆的结果。酪氨酸重组酶的代表是Cre、FLP、λ整合酶、XerC/D。它们的催化机制是活性位点的酪氨酸羟基攻击DNA的磷酸骨架形成共价的3-磷酸酪氨酰中间体切开一条链交换、再连接形成Holliday中间体最后再切另一对链完成整个过程。中间会短暂出现一个四链交叉的结构需要四个重组酶单体每个识别位点两个组成复合物。这个机制的产物特点是反应是可逆的正反应和逆反应用同一套化学方向由位点排列和辅助蛋白决定。丝氨酸重组酶的代表是Tn3解离酶、γδ解离酶、Sin、β-six。它们的催化残基是丝氨酸攻击后形成5-磷酸丝氨酰中间体而且是一次性切断全部四条链在空间上旋转120度再连接回去。整个过程不形成Holliday中间体也不可逆。产物类型同样由位点方向和空间排列决定但因为没有可逆性一旦接上就锁死了。这两套机制的区别在实验里很实用需要可逆、需要切除比如把标记框从中间拿掉酪氨酸重组酶更合适Cre-loxP就是典型。需要不可逆的、一次性的整合比如把一段序列稳定插进基因组之后不再动丝氨酸重组酶的不可逆性反而是优点很多整合型载体用的是这一类。需要在体外做定点切断或连接也要看这个区别酪氨酸重组酶做体外反应时需要严格控制离子强度和ATP某些成员依赖丝氨酸重组酶对条件更宽容一些。3.2 λ整合与切除方向性怎么被辅助蛋白决定λ整合酶是酪氨酸重组酶里最讲究的一个因为它不是随便找个位点就重组而是必须同时认attP噬菌体上的位点和attB细菌上的位点而且需要宿主因子IHF参与把DNA弯出特定的构象。整合的结果是生成attL和attR两个新的位点这两个位点不再被整合酶单独识别——除非有切除酶Xis一起工作把反应推回切除方向。这个方向由辅助蛋白决定的设计是这一章里我觉得最精巧的地方。它意味着整合反应是单向的因为attL/attR对整合酶来说不构成有效底物没有Xis就回不去。切除反应需要两个蛋白同时到位这就给了宿主一个调控开关——Xis的表达时机决定了什么时候可以切出来。辅助蛋白的作用方式是改变DNA构象不是简单的招募所以它对序列的上下文很敏感换一段侧翼序列效率就可能变。我读这一节时想到的是实验中的对应现象用重组酶做标记回收的时候如果两侧的位点距离太近、或者侧翼序列的弯曲性不好切除效率会明显下降。教材里讲λ的辅助蛋白是为了解释噬菌体的生活史但这个原理在人工系统里同样成立——重组酶不是万能剪刀它对底物的三维构象有要求。3.3 Cre-loxP与FLP-FRT方向决定删除、倒位、易位到了应用层面Cre-loxP和FLP-FRT是两个绕不开的系统。它们的共同点是识别位点短、重组效率高、不需要辅助因子区别在于识别位点的序列和长度。loxP是34 bp结构是13 bp反向重复 8 bp间隔区 13 bp反向重复间隔区是不对称的这个不对称性决定了位点的方向性。FRT是48 bp间隔区8 bp同样是反向重复加不对称间隔区。两者的间隔区序列不同所以Cre不认FRTFLP不认loxP这就允许在同一细胞里同时跑两套系统。产物类型完全由两个位点的相对方向决定这一点我在纸上画了无数遍才形成肌肉记忆两个位点的排列重组结果典型用途同向位于同一DNA分子删除中间片段保留一个位点标记去除、基因敲除、报告基因激活反向位于同一DNA分子倒位中间片段开关式表达、方向翻转位于两条不同DNA分子整合或易位定点整合、染色体工程同向位于不同分子共整合大片段组装体外这张表是设计任何Cre实验的起点。我见过最常见的错误是把两个loxP的方向画反了然后纳闷为什么筛选出来的克隆是倒位而不是删除——测序一看间隔区方向确实反了。所以我现在养成一个习惯设计完先不急着合成把两个loxP的间隔区序列抄出来用对齐软件比一下方向确认是头尾同向还是头头相对。还有一个细节loxP位点之间如果距离太短比如小于100 bp重组效率会下降因为两个位点在同一时刻被同一个四聚体抓住的概率降低距离太长比如超过几十kb效率也会下降因为两个位点在空间上不容易凑到一起。经验区间大概是几百bp到十几kb这个范围内成功率最高。具体数值随细胞类型变化我一般会同时做两个不同间距的构建选活的那个。3.4 从工具到应用这套系统的能力边界位点特异性重组在实验室里的应用谱系很宽但每一项都有边界我按用途列一下自己常用的几类第一类条件性基因敲除。在两个关键外显子两侧放同向loxP配上组织特异性或诱导型Cre就能实现时空可控的敲除。边界在于外显子不能被完全删除导致阅读框彻底乱掉有时候保留一个能表达部分蛋白的等位基因反而更有用loxP不能插在调控元件里两个loxP之间的片段不能包含必需的剪接信号。第二类报告基因激活谱系追踪。在一个通用启动子后面放停止框由两侧同向loxP夹住再放荧光蛋白Cre一到就切掉停止框荧光打开。边界在于停止框的泄漏表达是常见问题需要设计得足够严否则没加Cre也会有微弱信号做谱系追踪时会误判。第三类重组介导的盒式交换RMCE。用两个不相容的lox位点比如loxP和lox2272夹住一个标记框再用带相同位点组合的供体去做交换可以做到无痕替换。这个方法的边界是两个位点必须是不相容的否则会发生单个位点之间的重组导致整个结构塌掉供体的量要给足交换效率通常低于单次删除。第四类体外DNA组装。用重组酶在体外把多个片段按顺序接起来识别位点设计在片段两端。边界在于接完以后位点会留在连接处如果这段序列要表达蛋白位点可能影响翻译或折叠所以更适合做非编码区的组装。4. 把这一章变成手上的活一次同源重组敲除的完整落地4.1 设计阶段供体形式、同源臂长度与sgRNA位置我从第15章里拎出来的最实用的一条经验是供体形式要和你想做的改动规模匹配。小改动点突变、短插入、短缺失用单链寡核苷酸中等改动几百bp到2kb用带同源臂的双链片段大改动整段基因替换用质粒或长片段供体。同源臂长度的经验值我整理成这样供体类型每侧同源臂长度适用场景备注单链寡核苷酸30~60 nt点突变、短标签插入总长控制在90~200 nt太长合成成本高、转化效率降双链PCR片段500~1000 bp1~3 kb的替换或插入片段两端要做纯化避免残留模板干扰环状质粒1~3 kb大片段替换、加筛选标记线性化后效率通常更高sgRNA的位置也有讲究。切口离改动位点越近同源重组把改动抄进去的概率越高但太近比如切口就在改动位点上会导致供体被切所以常规做法是把切口放在改动位点附近10~30 bp同时在供体上把PAM序列做成同义突变防止Cas9再切一次。这个沉默PAM的操作我觉得是整章内容落到实验里最有价值的一个细节——很多人做点突变效率低就是栽在供体被反复切割上。4.2 参数与计算转染量、摩尔比、筛选窗口参数这块我喜欢把账算清楚而不是凭感觉加量。下面是我常用的一套估算方法供参考。先算细胞数和阳性事件数。假设电转1×10^6个细胞同源重组效率5%这是很多细胞系做ssODN敲入的量级那阳性细胞大概5×10^4个。如果要靠有限稀释拿到单克隆96孔板每孔铺0.5个细胞理论上有阳性孔的期望值就是5×10^4/2 ≈ 2.5×10^4个孔这个数字远远超过实际需要的孔数说明效率5%其实已经够用了真正的瓶颈在验证和克隆化不在转染。再算摩尔比。Cas9蛋白和sgRNA的摩尔比一般给1:1.2到1:1.5让sgRNA过量一点保证装载供体和RNP的摩尔比ssODN可以给到10:1甚至更高因为ssODN便宜、毒性低双链质粒供体一般给1:1到3:1太高会有毒性。这个比例不是拍脑袋它来自每个细胞里RNP数量有限、供体要抢在切口被修复之前到位这个竞争关系供体少了竞争不过内源修复供体多了细胞负担重。筛选窗口方面如果用抗性标记嘌呤霉素这类药物一般转染后24~48小时开始加加药持续2~4天然后撤药恢复。窗口太短筛不干净太长会把阳性克隆也拖死。这个时间点跟细胞倍增时间强相关倍增慢的细胞要相应延长。一个可复用的小脚本用来快速算ssODN的Tm和GC避免每次都手算def ssodn_tm(seq): seq seq.upper() a seq.count(A); t seq.count(T) g seq.count(G); c seq.count(C) gc (g c) / len(seq) * 100 # 长寡核苷酸用 Wallace 规则只是粗略估计50 nt 建议用最近邻法 tm 64.9 41 * (g c - 16.4) / len(seq) return round(gc, 1), round(tm, 1) print(ssodn_tm(A*30 GC*15 T*30))我通常要求ssODN的GC含量落在40%~60%Tm和退火温度匹配到±3度以内。超出这个范围合成就先别下回去调序列。4.3 验证阶段三级验证与克隆化策略验证这一块我的做法是三级的从粗到细第一级是 junction PCR。一条引物落在同源臂外侧的基因组序列上另一条落在插入片段或改动位点内部扩增产物大小能区分野生型和重组型。这一步用来快速筛池子通常转染后5~7天就能做。注意引物不要落在同源臂内部否则野生型也会出带判断不了。第二级是两侧都验。5端和3端各做一对确认整段供体是完整整合进去的而不是只进了半截。我踩过一次坑只验了5端结果拿到一个克隆3端其实是随机插入的白白养了两周。第三级是测序和拷贝数。把junction的PCR产物直接测序确认没有额外突变再用定量PCR估一下拷贝数排除多拷贝串联整合。这一步对于要拿去做功能实验的克隆是必须的因为多拷贝会导致表达量异常表型解释不通。克隆化策略上我一般会挑2~3个独立克隆、用两套不同的sgRNA各做一次只有两套都拿到一致的表型才认为结论可靠。这个习惯来自一个教训早期我只用一个sgRNA做了一个克隆表型很漂亮后来发现那个克隆的靶基因附近有一段自发缺失表型其实是缺失造成的跟编辑无关。4.4 Cre-loxP条件敲除的踩坑细节把同源重组和位点特异性重组接起来用的典型场景就是先做floxed小鼠或floxed细胞系再用Cre触发敲除。这一步的坑比设计loxP本身多得多。第一个坑是loxP的位置。我的一般原则是夹住的关键外显子要包含起始密码子之后的第一个功能域且删除后能造成移码loxP不要插在外显子内部会破坏剪接要放在内含子里离剪接位点至少留50~100 bp。第二个坑是Cre的剂量和递送方式。瞬时转染Cre质粒表达窗口短适合做切完就走的实验病毒递送表达强而持久适合做组织特异性敲除但要小心持续表达带来的毒性。诱导型Cre他莫昔芬依赖的剂量窗口很窄量不够切不干净量过了会有明显的旁效应我一般会做一个剂量梯度取剪切效率最高、细胞状态最好的那个点。第三个坑是切了但没完全切。群体水平的PCR能看到缺失带不代表每个细胞都切了。做表型实验之前最好做一次单克隆分离或者用有限稀释把剪切阳性的细胞纯化出来否则表型会被未切细胞稀释。第四个坑是残留位点。切完以后基因组里会留一个loxP如果后续还要用同一套系统做第二次操作这个残留位点可能会参与重组造成意外缺失。这一点在第15章里没有明说但它是我在实际项目里真真切切遇到的现在做多轮编辑时会优先考虑用不相容的位点组合。5. 排查手册重组实验的常见翻车与对策5.1 速查表现象最可能的原因排查动作对策同源重组效率极低几乎没有阳性供体被反复切割检查供体上PAM是否沉默做同义突变或改用ssODN有阳性但3端验不过供体断裂或部分整合加做3端junction PCR供体做全长纯化避免残留模板克隆之间表型不一致克隆异质性、脱靶多克隆测序、脱靶位点检查至少两个独立克隆、两套sgRNACre切不干净Cre剂量不足或表达窗口短做剂量梯度、延长诱导时间换递送方式或改用诱导型没加Cre也有信号停止框泄漏检查停止框长度和剪接信号加长停止框或换用双停止框倒位而非删除loxP方向画反比对间隔区序列方向重新设计方向对齐重组后表达量异常高多拷贝整合定量PCR估拷贝数挑单拷贝克隆体外重组反应做不出带ATP耗尽或Mg离子不足检查缓冲液、加再生系统补ATP再生系统调离子强度5.2 几条不太写在手册里的经验第一先做小体系验证再放大。第15章的机制图看着简单实际体系里的变量极多我现在的习惯是先用24孔板做小规模把转染量、供体量、时间点摸清楚再上大体系。一次性上大体系失败了根本不知道是哪个变量的问题。第二把阴性对照当成主角来设计。同源重组实验里最有信息量的往往不是阳性组而是不加供体不加sgRNA加供体但不加Cas9这三组阴性对照。它们能告诉你是背景重组、还是非特异整合、还是真的发生了同源重组。我见过太多人只做阳性组拿到带就发文章后来被审稿人一问就露馅。第三重组酶系统的残留活性要提前想。细胞里可能有内源的Cre-like活性或者你用的报告系统本身就有背景。做谱系追踪这类长周期实验时我会先做一个不加Cre、养足够长时间的对照看背景信号什么时候起来再决定实验窗口。第四读第15章的正确姿势是带着图读。这一章的图非常多而且每张图都在讲一个不同层次的事情有的是化学机制有的是遗传学后果有的是实验设计。我第一遍读文字读得很痛苦第二遍改成先看图注、再看正文理解速度快了一倍。图注里往往藏着关键限定条件比如在某某条件下仅在某某蛋白存在时这些限定才是机制的真正边界。第五别把教材里的模型当成唯一真相。同源重组的模型在过去几十年里一直在修订DSBR、SDSA、还有各种单链退火模型它们不是互斥的而是在不同情境下各自成立。做实验时选哪个模型当工作假设取决于你的体系做有丝分裂的点突变敲入按SDSA的思路设计供体做减数分裂相关的交换研究按DSBR的思路理解产物比例。这种按需选模型的思路比死记一个版本要实用得多。最后分享一个我自己养成的习惯每读完一章我会强迫自己用一页纸画出这一章能变成哪三个实验。第15章给我的三个实验是——一个同源重组介导的点突变敲入、一个Cre-loxP条件删除、一个体外重组酶组装。画完这三个实验章节里的蛋白名字就不再是名词表而是一张张可以动手的流程图。这个习惯坚持了几年回头看去真正留在脑子里的知识几乎都是那些我动手做过的部分。
