蛋白质很少“单打独斗”信号转导、基因转录、代谢调控等大部分生命活动都依赖于蛋白质相互作用Protein-Protein Interactions, PPI。我们在进行机制探索、通路验证、靶点确认、药物筛选时遇到过这些困惑吗想验证两个蛋白是否互作应该做Co-IP还是Pull-down想看活细胞内动态互作是不是要做FRET、BRET或NanoBiT想研究信号通路用IP-MS还是TurboID/BioID想证明“直接结合”并测亲和力应该选SPR、BLI、MST或ITC问题不是“有没有办法”而是“方法太多不知道选哪个”。Co-IP、Pull-down、FRET、SPR、BLI、IP-MS……这些技术都能研究“蛋白互作”但解决的问题不同。Co-IP阳性并不能直接证明两个蛋白存在直接结合FRET也不能简单等同于形成稳定复合物SPR回答的是另一层面的结合亲和力问题。因此选择蛋白互作技术之前首先需要明确究竟想获得哪一层证据然而许多科研人员在设计课题时常陷入技术选型的误区耗费数月做Co-IP却因结合较弱导致阳性信号缺失或者在酵母双杂交Y2H中筛出一堆克隆后期验证时却发现大多是假阳性。选错技术不仅浪费宝贵的样品与试剂更容易耽误课题进度。成熟的蛋白互作研究必须——技术组合多层验证。一、选择之前先问清楚4个问题1.1确定研究的核心问题是什么比如是否存在互作、是否直接结合、结合强弱、互作是否发生在活细胞内、是否受刺激调控、是否需要对整个互作体系进行研究1.2确定研究的样本类型是什么细胞裂解液、纯化的重组蛋白、活细胞、组织样本、体内样本……1.3确定研究对象的有哪些特点互作是否较弱或瞬时、是否依赖翻译后修饰、是否属于膜蛋白、是否存在多亚基复合物1.4确定想要得到哪类数据定性、定量还是定位动力学或亲和力数据互作信号通路或互作区域、关键位点、调控条件等机制信息二、一张表了解10种蛋白互作技术技术体内/体外筛选/验证定量能力样本类型主要应用Co-IP体内验证半定量细胞裂解液已知互作验证Pull-down体外筛选/验证半定量纯化蛋白、裂解液直接互作验证SPR体外验证定量纯化蛋白亲和力测定BLI体外验证定量纯化蛋白亲和力测定MST体外验证定量纯化蛋白亲和力测定Y2H体内筛选酵母细胞筛选未知互作FRET体内验证半定量活细胞互作动态追踪NanoBiT体内验证半定量活细胞互作动态追踪ITC体外验证定量纯化蛋白热力学分析IP-MS体外验证半定量/定量细胞/组织互作网络解析三、10种技术分别适合哪些场景3.1免疫共沉淀Co-IP验证体内天然互作Co-IP是研究体内蛋白互作的经典方法用于确定两种蛋白质在完整细胞内的相互作用。实验采用非变性温和裂解液在保留细胞内天然蛋白质复合物结构的前提下用靶蛋白抗体“钓”出复合物。用Protein A/G磁珠捕获抗体-蛋白复合物反复洗涤去除杂蛋白。洗脱复合物后通过WB检测已知互作蛋白或用质谱鉴定未知互作蛋白。Co-IP在接近生理条件的环境下进行能够保留天然构象及辅助亚基适用于验证生理状态下的蛋白互作还能排除过表达造成的假阳性。Co-IP还可检测依赖于修饰的蛋白互作以及检测多个潜在互作“搭子”。Co-IP阴性不一定代表不存在互作阳性也不能证明直接结合无法排除通过第三方蛋白形成的间接结合。如果需要进一步区分则需要进行体外重组实验如GST pull-down进行验证。半定量Co-IP实验技术操作流程源自文献https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.1006443.2Pull-down体外验证直接结合Pull-down是体外验证蛋白质相互作用的经典技术核心是将带有GST、His、Strep等标签的诱饵蛋白固定于固相亲和载体与纯化蛋白或细胞裂解液共同孵育以捕获结合蛋白经洗涤去除非特异性结合后通过SDS-PAGE、免疫印迹或质谱分析鉴定互作关系。Pull-down体系条件可控可精准调控缓冲液组成、离子强度与辅因子既能验证蛋白二元直接互作、排除细胞内间接桥接干扰也可用于筛选未知结合蛋白、定位蛋白互作结构域。但体外重组蛋白易出现折叠、聚集异常且缺乏翻译后修饰可能遗漏PTM依赖型互作可通过加入ATP、Mg2等辅因子或采用哺乳动物表达系统优化。GST Pull-down实验体系及质谱、WB验证结果源自文献https://doi.org/10.1371/journal.pone.02656923.3SPR定量检测结合与解离速率表面等离子共振SPR是无标记、实时的生物分子互作定量检测技术。其原理为将诱饵蛋白固定于金膜芯片表面待测分子流经时发生结合会引起芯片表面折射率改变通过共振角位移实时记录结合-解离动态曲线可精确计算平衡解离常数KD、结合速率kon、解离速率koff等动力学参数。该技术无需荧光或同位素标记灵敏度可达μM至nM级适用于蛋白-蛋白、蛋白-核酸、蛋白-小分子互作分析及药物靶点筛选。但该技术对样品纯度要求高检测成本高、通量较低更适合关键互作的定量验证而非大规模初筛。3.4BLI并行高通量分析生物膜干涉技术BLI是一种无标记、光学生物传感技术实时定量分析生物分子相互作用的结合强度与动力学。其原理是将配体固定于光纤探头末端的生物传感器表面浸入样品后蛋白互作结合引起传感器表面的干涉光谱发生位移实时监测结合过程。BLI抗杂质干扰能力强血清、培养基等粗样本可直接检测。检测通量更高可并行检测多个样本与浓度梯度样品消耗量低于SPR适用于抗体筛选、蛋白突变体亲和力比较、中高通量药物筛选等场景。实验需摸索蛋白固定化条件同时需注意蛋白聚集、多价结合等因素会干扰结果准确性。3.5MST少量样品也能测亲和力微量热泳动MST基于温度梯度场中分子热泳泳动效应。其原理为对靶蛋白进行荧光标记通过红外激光在毛细管内建立微尺度温度梯度分子因尺寸、电荷及水合层特性差异呈现不同热泳速率配体与靶蛋白结合形成复合物后上述性质改变引发热泳信号偏移通过浓度梯度滴定拟合曲线即可计算解离常数Kd、结合化学计量比及热力学参数定量表征两个蛋白之间的亲和力强弱。该技术在均相溶液中检测样本消耗量低适合蛋白样品量有限的研究。但不同体系信号窗口差异较大荧光标记、缓冲液成分、蛋白聚集及非特异吸附均会影响结果需结合体系优化条件。3.6Y2H筛选潜在的互作蛋白酵母双杂交Y2H是经典的体内遗传学蛋白互作筛选技术基于转录因子功能重构原理将诱饵蛋白与转录因子DNA结合域BD融合猎物蛋白与转录激活域AD融合两蛋白互作则使BD与AD空间靠近重构完整转录因子驱动HIS3、LacZ等报告基因表达通过营养缺陷筛选或显色反应检测互作。Y2H可检测微弱、瞬时互作还可进行全基因组筛选一次性筛查数千至数万个潜在互作蛋白。实验在活细胞内进行无需纯化蛋白。存在假阳性风险常与Co-IP联用。3.7FRET观察活细胞中的互作荧光共振能量转移FRET在供体和受体荧光团距离足够近10nm时供体受激发后将能量转移至受体受体发光通过检测发射光谱变化判断是否互作。FRET可实时追踪活细胞内蛋白互作的时空变化明确互作的亚细胞定位适用于信号传导、蛋白转运、构象变化等动态过程研究。3.8NanoBiT实时监测活细胞互作变化NanoBiT属于分裂荧光素酶互补技术将NanoLuc荧光素酶裂解为一个大片段LgBiT和一个小的高亲和力肽HiBiT。蛋白互作时两个亚基重构恢复荧光素酶活性并产生发光信号能够以最小的扰动实现蛋白质的灵活标记和定量。NanoBiT技术不需要外源激发光背景信号较低、灵敏度高适合监测配体、药物或信号刺激引起的微弱或瞬时互作用于活细胞或生物体内蛋白互作的实时检测。检测操作简单、信号稳定适合96/384孔板的高通量筛选格式。3.9ITC进一步回答为什么结合等温滴定量热法ITC在恒定温度下直接测量复合物形成过程中的热量变化通过测量互作时吸收或放出的热量拟合计算得到解离常数、自由能等参数。实验过程无需固定化修饰蛋白在接近生理状态的溶液中反应样品不会遭到破坏可回收继续实验。但需要毫克级高纯度的蛋白样品消耗量较大。对亲和力过高或焓变小的互作检测灵敏度有限常与SPR、BLI技术联用。3.10AP-MS/IP-MS全景解析互作网络这是亲和纯化或免疫沉淀与质谱联用的蛋白互作网络分析技术通过免疫沉淀或标签亲和纯化富集诱饵蛋白及其结合复合物经胰酶消化后通过液相色谱-串联质谱鉴定可一次性获得数十至数百个候选互作蛋白。实验保留蛋白质的天然修饰与胞内互作环境结合GO、KEGG等数据库可系统解析互作网络、挖掘新调控机制。但存在假阳性风险高丰度蛋白、非特异吸附、过表达易干扰结果。需设置IgG、空白微珠等对照候选蛋白需用一对一Co-IP或其他方法二次验证。四、到底怎么选按实验需求匹配技术4.1根据实验目的选· 探索全新机制优先选择IP-MS。· 验证已知假设首选Co-IP与Pull-down的组合。· 回答动力学机制选择SPR、BLI或MST。4.2评估蛋白性质· 难溶蛋白/膜蛋白建议采用临近标记或酵母双杂交。· 依赖翻译后修饰如磷酸化、泛素化优先选择Co-IP。4.3建立完整数据闭环高水平研究往往不依赖单一技术而是构建多维度互补的证据链· 预测/筛选Y2H或IP-MS 筛选。· 体内结合Co-IP。· 体外结合GST Pull-down。· 定位与突变荧光共定位、FRET、Cryo-EM。· 互作强度SPR、BLI金标准组合通常Co-IP体内Pull-down体外SPR/BLI定量。
